Stosowanie i środki ostrożności dotyczące probówki wirówkowej do ultrafiltracji
1) Wybierz odpowiednią rurkę ultrafiltracyjną.Należy pamiętać, że membrany UF różnią się poziomem tolerancji na różne chemikalia.Typowo, można wybrać probówki ultrafiltracyjne z wartością odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa z wartością odcięcia masy cząsteczkowej, która nie powinna być większa niż 1/3 masy cząsteczkowej interesującego białka, np. 35 kDa.Jeśli masa cząsteczkowa białka będącego przedmiotem zainteresowania wynosi około 10 kD, można zastosować rurkę ultrafiltracyjną z wartością odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącą 3 KD.
(2) Ultrafiltracja, świeżo zakupiona, jest sucha, przed użyciem dodaje się ultraczystą wodę i całkowicie przepuszcza wodę przez membranę, łaźnię lodową lub wstępnie schłodzoną przez kilka minut lodówkę.Następnie wylewa się wodę, czyli płyn białkowy i dodaje się taką ilość, która nie przekracza białej linii na górze probówki.Operacja jest lekka, a rurkę ultrafiltracyjną należy wstępnie schłodzić na lodzie przed dodaniem roztworu białka.
3) Zarówno masa jak i środek ciężkości miały osiągnąć równowagę.Należy pamiętać, że prędkość obrotowa i przyspieszenie nie są zbyt duże, w przeciwnym razie bezpośrednio uszkadzają membranę ultrafiltracyjną.Rozpoczęto ultrafiltrację odśrodkową (wirówka schłodzona do 4 stopni).Po przeliczeniu obrotów różnych wirówek na g okazało się, że jest inaczej.Przyspieszenie wirówki dostosowano do minimum, zmniejszając nacisk na membranę.Uwaga, pamiętaj o pozostawieniu wirówki po tym, jak wirówka osiągnie docelową prędkość, w przeciwnym razie, jeśli pojawi się problem, nie dasz sobie z nim rady po raz pierwszy.Orientację membrany względem wrzeciona wyregulowano zgodnie z instrukcją (obudowa wirówki kątowej jest ustawiona prostopadle do osi membrany).W praktyce ogólna prędkość obrotowa jest niższa niż podana w instrukcji, co pozwala wydłużyć żywotność probówki wirówki.
3) Zarówno masa jak i środek ciężkości miały osiągnąć równowagę.Należy pamiętać, że prędkość obrotowa i przyspieszenie nie są zbyt duże, w przeciwnym razie bezpośrednio uszkadzają membranę ultrafiltracyjną.Rozpoczęto ultrafiltrację odśrodkową (wirówka schłodzona do 4 stopni).Po przeliczeniu obrotów różnych wirówek na g okazało się, że jest inaczej.Przyspieszenie wirówki dostosowano do minimum, zmniejszając nacisk na membranę.Uwaga, pamiętaj o pozostawieniu wirówki po tym, jak wirówka osiągnie docelową prędkość, w przeciwnym razie, jeśli pojawi się problem, nie dasz sobie z nim rady po raz pierwszy.Orientację membrany względem wrzeciona wyregulowano zgodnie z instrukcją (obudowa wirówki kątowej jest ustawiona prostopadle do osi membrany).W praktyce ogólna prędkość obrotowa jest niższa niż podana w instrukcji, co pozwala wydłużyć żywotność probówki wirówki.
(4) Po zatężeniu do pozostałego 1 ml, pobrać 50 ul roztworu buforowego, dodać 10 ul przepływającego płynu i sprawdzić, czy pojawia się niebieskie zabarwienie, co pozwala ocenić, czy w rurce ultrafiltracyjnej brakuje białka.Jeżeli rurka jest nieszczelna, należy ponownie wlać górną warstwę i przelać do nowej probówki, aby rozpocząć ultrafiltrację.Aby dokładnie określić, czy pominięto probówki, wiruj przez 10 minut z 5 mgml BSA przed przepływem, używając kleju białkowego lub surowego testu Bradforda i kontynuuj dodawanie pozostałego stężonego roztworu białka (który działa na lodzie i zapobiega podgrzewaniu białek) aż do momentu dodano cały koncentrat.Zachować ostrożność podczas wirowania, jeśli nastąpi wytrącenie białek prowadzące do zamknięcia probówki.Jeżeli wystąpią opady, należy określić, czy konkretną przyczyną opadów jest nadmierne stężenie białka, czy też nieodpowiedni bufor;To pierwsze można rozwiązać poprzez ultrafiltrację wielu rurek ultrafiltracyjnych jednocześnie, zmniejszając stężenie, a to drugie, wymieniając różne roztwory buforowe, aż do momentu, w którym nie nastąpi wytrącanie się białka.
(4) Po zatężeniu do pozostałego 1 ml, pobrać 50 ul roztworu buforowego, dodać 10 ul przepływającego płynu i sprawdzić, czy pojawia się niebieskie zabarwienie, co pozwala ocenić, czy w rurce ultrafiltracyjnej brakuje białka.Jeżeli tuba jest nieszczelna, należy ponownie wlać górną warstwę i przelać do nowej probówki, aby rozpocząć ultrafiltrację.Aby dokładnie określić, czy pominięto probówki, wiruj przez 10 minut z 5 mgml BSA przed przepływem, używając kleju białkowego lub surowego testu Bradforda i kontynuuj dodawanie pozostałego stężonego roztworu białka (który działa na lodzie i zapobiega podgrzewaniu białek) aż do momentu dodano cały koncentrat.Zachować ostrożność podczas wirowania, jeśli nastąpi wytrącenie białek prowadzące do zamknięcia probówki.Jeżeli wystąpią opady, należy określić, czy konkretną przyczyną opadów jest nadmierne stężenie białka, czy też nieodpowiedni bufor;Ten pierwszy można rozwiązać poprzez ultrafiltrację wielu rurek ultrafiltracyjnych jednocześnie, zmniejszając stężenie, a drugi poprzez wymianę różnych roztworów buforowych, aż do momentu, w którym nie nastąpi wytrącanie się białka.
(5) Kilka pierwszych kroków ma na celu zatężenie białka, a jeśli bufor ma zostać zmieniony, delikatnie dodaj nowy bufor (ultrafiltracja przez membranę ultrafiltracyjną o średnicy 0,22 µm) do około 1 ml całkowitego białka i ponownie zatęż do około 1 ml przez trzy kolejne razy, przy czym końcowa zatężona objętość końcowa zależy od pożądanego stężenia białka, na ogół nie więcej niż 500 ul, ale także w granicach 200 ul.Osiągnij 1000 × lub więcej trzykrotnie, zasadniczo tyle samo zmian bufora, ile obliczono przy co najmniej 10 × lub więcej wzbogacaniu objętości za każdym razem.
(5) Kilka pierwszych kroków ma na celu zatężenie białka, a jeśli bufor ma zostać zmieniony, delikatnie dodaj nowy bufor (ultrafiltracja przez membranę ultrafiltracyjną o średnicy 0,22 µm) do około 1 ml całkowitego białka i ponownie zatęż do około 1 ml przez trzy kolejne razy, przy czym końcowa zatężona objętość końcowa zależy od pożądanego stężenia białka, na ogół nie więcej niż 500 ul, ale także w granicach 200 ul.Osiągnij 1000 × lub więcej trzykrotnie, zasadniczo tyle samo zmian bufora, ile obliczono przy co najmniej 10 × lub więcej wzbogacaniu objętości za każdym razem.
Czas publikacji: 09 listopada 2022 r