PCR, to reakcja łańcuchowa polimerazy, która odnosi się do dodania dNTP, Mg2+, czynników wydłużania i czynników wzmocnienia amplifikacji do układu w ramach katalizy polimerazy DNA, z wykorzystaniem macierzystego DNA jako matrycy i specyficznych starterów jako punktu początkowego wydłużania, Poprzez etapy denaturacji, przyłączania, wydłużania itp., proces replikacji in vitro nici potomnej DNA komplementarnej do matrycy DNA nici macierzystej może szybko i specyficznie amplifikować dowolny docelowy DNA in vitro.
1. PCR na gorąco
Czas rozpoczęcia amplifikacji w konwencjonalnym PCR nie polega na umieszczeniu maszyny PCR w maszynie PCR, po czym program rozpoczyna amplifikację.Po zakończeniu konfiguracji systemu rozpoczyna się amplifikacja, która może spowodować nieswoistą amplifikację, a PCR z gorącym startem może rozwiązać ten problem.
Co to jest PCR z gorącym startem?Po przygotowaniu układu reakcyjnego modyfikator enzymu jest uwalniany w wysokiej temperaturze (zwykle wyższej niż 90°C) podczas początkowego etapu ogrzewania reakcji lub etapu „gorącego startu”, tak że polimeraza DNA zostaje aktywowana.Dokładny czas i temperatura aktywacji zależą od charakteru polimerazy DNA i modyfikatora gorącego startu.W metodzie tej wykorzystuje się głównie modyfikatory, takie jak przeciwciała, ligandy powinowactwa lub modyfikatory chemiczne w celu hamowania aktywności polimerazy DNA.Ponieważ aktywność polimerazy DNA jest hamowana w temperaturze pokojowej, technologia gorącego startu zapewnia dużą wygodę podczas przygotowywania wielu systemów reakcji PCR w temperaturze pokojowej bez utraty specyficzności reakcji PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR z odwrotną transkrypcją) to eksperymentalna technika odwrotnej transkrypcji z mRNA do cDNA i wykorzystania go jako matrycy do amplifikacji.Procedura eksperymentalna polega na wyekstrahowaniu najpierw całkowitego RNA z tkanek lub komórek, zastosowaniu Oligo (dT) jako startera, zastosowaniu odwrotnej transkryptazy do syntezy cDNA, a następnie wykorzystania cDNA jako matrycy do amplifikacji PCR w celu uzyskania docelowego genu lub wykrycia ekspresji genu.
3. Fluorescencyjna ilościowa PCR
Fluorescencyjny ilościowy PCR (ilościowy PCR w czasie rzeczywistym,RT-qPCR) odnosi się do metody dodawania grup fluorescencyjnych do układu reakcji PCR, wykorzystania akumulacji sygnałów fluorescencyjnych do monitorowania całego procesu PCR w czasie rzeczywistym i na koniec wykorzystania krzywej standardowej do ilościowej analizy matrycy.Powszechnie stosowane metody qPCR obejmują SYBR Green I i TaqMan.
4. Zagnieżdżona PCR
Nested PCR odnosi się do zastosowania dwóch zestawów starterów PCR w dwóch rundach amplifikacji PCR, a produktem amplifikacji drugiej rundy jest docelowy fragment genu.
Jeśli niedopasowanie pierwszej pary starterów (starterów zewnętrznych) powoduje amplifikację nieswoistego produktu, możliwość rozpoznania tego samego nieswoistego regionu przez drugą parę starterów i kontynuacji amplifikacji jest bardzo mała, więc amplifikacja przez drugą parę starterów poprawia specyficzność PCR.Jedną z zalet przeprowadzenia dwóch rund PCR jest to, że pomaga to w amplifikacji wystarczającej ilości produktu z ograniczonego wyjściowego DNA.
5. PCR przyziemny
Touchdown PCR to metoda poprawy specyficzności reakcji PCR poprzez dostosowanie parametrów cyklu PCR.
W touchdown PCR temperaturę przyłączania przez kilka pierwszych cykli ustala się o kilka stopni powyżej maksymalnej temperatury przyłączania (Tm) starterów.Wyższa temperatura przyłączania może skutecznie zmniejszyć nieswoistą amplifikację, ale jednocześnie wyższa temperatura przyłączania pogorszy rozdział starterów i sekwencji docelowych, co skutkuje zmniejszoną wydajnością PCR.Dlatego też w ciągu pierwszych kilku cykli temperaturę wyżarzania zwykle obniża się o 1°C na cykl, aby zwiększyć zawartość docelowego genu w układzie.Po obniżeniu temperatury wyżarzania do optymalnej temperatury, temperatura wyżarzania jest utrzymywana przez pozostałe cykle.
6. Bezpośrednia PCR
Bezpośredni PCR odnosi się do amplifikacji docelowego DNA bezpośrednio z próbki, bez konieczności izolacji i oczyszczania kwasu nukleinowego.
Istnieją dwa rodzaje bezpośredniej PCR:
metoda bezpośrednia: pobrać niewielką ilość próbki i dodać ją bezpośrednio do PCR Master Mix w celu identyfikacji PCR;
metoda krakingu: po pobraniu próbki dodać ją do lizatu, przeprowadzić lizę w celu uwolnienia genomu, pobrać niewielką ilość zlizowanego supernatantu i dodać go do PCR Master Mix, przeprowadzić identyfikację PCR.Takie podejście upraszcza przebieg eksperymentu, skraca czas pracy i pozwala uniknąć utraty DNA na etapach oczyszczania.
7. PCR SOE
Splicing genów poprzez wydłużanie zachodzących na siebie łańcuchów (SOE PCR) wykorzystuje startery z komplementarnymi końcami, aby produkty PCR tworzyły nakładające się łańcuchy, tak że w późniejszej reakcji amplifikacji, poprzez wydłużanie nakładających się łańcuchów, różne źródła techniki A, w której amplifikowane fragmenty nakładają się na siebie i łączone ze sobą.Technologia ta ma obecnie dwa główne kierunki zastosowań: konstrukcja genów fuzyjnych;mutacja ukierunkowana na miejsce genu.
8. IPCR
Odwrotna PCR (IPCR) wykorzystuje odwrotne, komplementarne startery do amplifikacji fragmentów DNA innych niż dwa startery i amplifikuje nieznane sekwencje po obu stronach znanego fragmentu DNA.
IPCR został pierwotnie zaprojektowany do określenia sekwencji sąsiadujących nieznanych regionów i jest najczęściej stosowany do badania sekwencji promotorów genów;onkogenne rearanżacje chromosomów, takie jak fuzja, translokacja i transpozycja genów;i integracja genów wirusa są obecnie powszechnie stosowane. W przypadku mutagenezy ukierunkowanej należy skopiować plazmid z pożądaną mutacją.
9. dPCR
Cyfrowa PCR (dPCR) to technika bezwzględnego oznaczania ilościowego cząsteczek kwasu nukleinowego.
Obecnie istnieją trzy metody ilościowego oznaczania cząsteczek kwasów nukleinowych.Fotometria opiera się na absorbancji cząsteczek kwasu nukleinowego;ilościowa fluorescencyjna PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR) opiera się na wartości Ct, a wartość Ct odnosi się do numeru cyklu odpowiadającego wartości fluorescencji, którą można wykryć;digital PCR to najnowsza technologia ilościowa oparta na metodzie jednocząsteczkowego PCR do zliczania kwasów nukleinowych. Kwantyfikacja jest metodą bezwzględnie ilościową.
Czas publikacji: 13 czerwca 2023 r